Ketika Kanako Miyamae pindah ke sekolah khusus perempuan yang baru, ia berharap bisa menemukan cinta sejati. Namun, yang ia temukan adalah Mariya Shidou yang cantik, teman sekelasnya yang menawan, yang Kanako temui di hari pertamanya. Namun, Mariya memiliki satu kekurangan: dia sebenarnya adalah anak laki-laki yang suka berpakaian silang! Setelah mengetahui rahasia Mariya dan terjebak bersamanya sebagai teman sekamarnya, hidup Kanako menjadi penuh kesialan. Yang dia inginkan hanyalah menemukan gadis impiannya, yang sulit dilakukan dengan campur tangan Mariya yang sadis dan pembantunya yang berlidah tajam, Matsurika Shinouji.

Maria†Holic Alive melanjutkan kisah Kanako yang harus berurusan dengan teman sekamar Mariya dan bertujuan untuk menemukan cinta sejati, sambil menjalani masa-masa SMA.