Dalam pencarian cinta sejati, Kanako Miyamae pindah ke Sekolah Katolik Ame no Kisaki, terinspirasi oleh cara orang tuanya jatuh cinta di sana. Namun, ada satu perbedaan: karena pria membuat Kanako gatal-gatal, dia sebenarnya datang ke sekolah khusus perempuan ini untuk mencari pasangan sesama jenis.

Ketika dia bertemu dengan Mariya Shidou yang cantik, Kanako yakin dia telah menemukan orang spesial itu; namun, ada lebih dari yang terlihat pada Mariya—ternyata cinta pertama Kanako sebenarnya adalah seorang pria yang berpakaian seperti wanita. Mariya mengancam akan mengungkap niat tidak suci Kanako kecuali dia menjaga rahasia jenis kelamin aslinya, dan untuk memperburuk keadaan, dia juga menggantikan teman sekamar aslinya agar bisa mengawasinya dengan lebih dekat.

Maria†Holic mengikuti Kanako saat dia mencari cinta di tempat yang salah dan mencari gadis impiannya—itu pun jika dia bisa bertahan menjadi teman sekamar Mariya!