Subaru Hasegawa berambisi untuk menjadi salah satu superstar bola basket terbaik sepanjang masa. Namun, hal ini terhenti ketika tim bola basket sekolahnya menghentikan kegiatannya selama satu tahun. Terkejut dengan berita tersebut, ia memutuskan untuk tidak lagi terlibat dalam bola basket.

Suatu hari, bibinya, Mihoshi Takamura, mengajaknya untuk melatih tim basket putri Akademi Keishin, dan dengan berat hati ia menyetujuinya. Dia bertemu dengan siswa kelas enam Tomoka Minato, Maho Misawa, Airi Kashii, Hinata Hakamada dan Saki Nagatsuki, dan mulai melatih mereka dalam olahraga ini dengan satu tujuan: mengalahkan semua lawan yang kuat di sepanjang jalan.

Ro-Kyu-Bu! mengikuti upaya lima gadis sekolah dasar dan pelatih mereka saat mereka meningkatkan gaya bermain bola basket mereka yang lucu.